泥鳅雌雄异体，体外受精。1冬龄的泥鳅一般已性成熟。在生殖季节，轻压成熟雄鳅的腹部可见白色精液流出，雌鳅腹部圆大，怀卵量因个体大小而异，多的达6.5万粒.卵直径0.8毫米-1.0毫米，吸水后膨胀到1.3毫米，卵无色透明半粘性。开春后，当水温达到18℃-20℃时，性成熟的泥鳅便开始自然繁殖。江南地区一般在4月底至5月初开始产卵。泥鳅多次产卵，每次历时4天-7天，产卵期可一直维持到8月份。产卵最盛期是5月中下旬到6月下旬。泥鳅常选择水田、池沼、沟渠、有清水流入的浅滩作为产卵场。5月-6月水温升高时，常在雨后或夜间产卵。发情时泥鳅在水的表层游动，几尾雄鳅追逐一尾雌鳅，发情高潮时有一尾雄鳅卷住雌鳅躯体，此时雌鳅产卵，雄鳅排精，这一动作能反复进行多次。受精卵粘附在水草或石头上，但泥鳅的受精卵粘性极差，虽能附着，但易从附着物上脱落而沉入水底。在饵料不足时，受精卵也会被泥鳅吞食掉。水温在19℃-24℃时，2天以后即可孵出鱼苗。